Què és l'anàlisi HRM (high resolution melting)?
És una tècnica emprada en biologia molecular per a la detecció de mutacions, polimorfismes i diferències epigenètiques en mostres d’ADN.
¿En qué consiste el análisis HRM?
El análisis HRM (high resolution melting) es un método de análisis posterior a la PCR utilizado para identificar la variación genética en las secuencias de ácidos nucleicos. Este método, sencillo y rápido, se basa en las técnicas de curva de fusión (disociación) de la PCR. El análisis de HRM puede discriminar las secuencias de ADN en función de su composición, longitud, contenido de GC o complementariedad de la cadena.
Quines aplicacions té l'anàlisi HRM?
Com funciona l'anàlisi mitjançant HRM?
A l’inici de l’anàlisi HRM hi ha una PCR (reacció en cadena de la polimerasa) per amplificar la regió d’ADN on hi ha la mutació, el polimorfisme o la diferència epigenètica d’interès. A més dels ingredients típics de qualsevol PCR (nucleòtids, polimerasa, magnesi), aquesta PCR inclou un agent fluorescent (per exemple SybrGreen) que durant l’amplificació s’intercala a la doble cadena d’ADN. Un cop finalitzada la PCR, al tub de la mostra hi ha moltes còpies de la regió d’ADN d’interès (coneguda com a amplicó).
Ara comença l’anàlisi de HRM en si, que consisteix en un escalfament precís de l’ADN de la mostra des d’uns 50 °C fins a uns 95 °C. En algun moment d’aquest procés, s’assoleix la temperatura de fusió de cadascun dels amplicons que presenten a la mostra i les dues cadenes d’ADN se separen.
La clau de l’anàlisi HRM és controlar la separació de les dues cadenes d’ADN en temps real. Per això actualment es disposa de diferents substàncies fluorescents que s’intercalen a l’ADN de doble cadena i quan estan unides a ell emeten una elevada fluorescència. Quan són en solució (no units a l’ADN) emeten una fluorescència baixa.
Al principi de l’anàlisi HRM hi ha un alt nivell de fluorescència a la mostra perquè gran part d’aquestes molècules fluorescents estan unides als milers de milions de còpies de l’amplicó (dels amplicons).
A mesura que la mostra s’escalfa i les dues cadenes d’ADN se separen, la presència d’ADN de doble cadena disminueix, les molècules fluorescents tornen a estar en solució i, per tant, la fluorescència es redueix. Aquesta disminució de la fluorescència comença lentament, però quan l’ADN de doble cadena passa a la forma monocatenària, es detecta una disminució abrupta de la fluorescència. Aquesta disminució sol ser més gran prop de la temperatura de fusió (Tm) de l’amplicó (dels amplicons). La Tm es defineix com el punt de la corba de fusió on el 50% de l’ADN és de doble cadena i el 50% és de cadena simple.
La màquina d’HRM posseeix un dispositiu capaç de mesurar la fluorescència de la mostra i un programari que permet representar les dades detectades en un gràfic conegut com a corba de fusió, que mostra el nivell de fluorescència enfront de la temperatura.
El perfil de fusió resultant reflecteix la barreja d’amplicons presents. Aspectes com el contingut de GC, la longitud, la seqüència i l’heterozigositat se sumaran a les característiques de la corba de fusió de cada amplicó. Els perfils resultants poden proporcionar informació valuosa per al cribratge de mutacions, el genotipat, la metilació i altres aplicacions de recerca.
