¿Qué es el análisis HRM (high resolution melting)?

En una técnica empleada en biología molecular para la detección de mutaciones, polimorfismos y diferencias epigenéticas en muestras de ADN.

¿En qué consiste el análisis HRM?

El análisis HRM (high resolution melting) es un  método de análisis posterior a la PCR utilizado para identificar la variación genética en las secuencias de ácidos nucleicos. Este método, sencillo y rápido, se basa en las técnicas de curva de fusión (disociación) de la PCR. El análisis de HRM puede discriminar las secuencias de ADN en función de su composición, longitud, contenido de GC o complementariedad de la cadena.

¿Cómo funciona el análisis mediante HRM?

Al inicio del análisis HRM hay una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para amplificar la región de ADN en la que se encuentra la mutación, el polimorfismo o la diferencia epigenética de interés. Además de los ingredientes típicos de cualquier PCR (nucleótidos, polimerasa, magnesio), esta PCR incluye un agente fluorescente (por ejemplo SybrGreen) que durante la amplificación se intercala en la doble cadena de ADN. Una vez finalizada la PCR, en el tubo de la muestra hay ahora muchas copias de la región de ADN de interés (conocida como amplicón).

 

¿Qué es la técnica de HRM (high resolution melting)?
Protocolo de una HRM (high resolution melting). Tras la PCR previa se procede al calentamiento preciso de la muestra (desnaturalización). La variación en la fluorescencia de la muestra queda registrada en una curva que permite interpretar los resultados.

Ahora comienza el análisis de HRM en sí, que consiste en un calentamiento preciso del ADN de la muestra desde unos 50˚C hasta unos 95˚C. En algún momento de este proceso, se alcanza la temperatura de fusión de cada uno de los amplicones presenten en la muestra y las dos cadenas de ADN se separan.

La clave del análisis HRM es controlar la separación de las dos cadenas de ADN en tiempo real. Para ello actualmente se dispone de diferentes substancias fluorescentes que se intercalan en el ADN de doble cadena y cuando están unidas a él emiten una elevada fluorescencia. Cuando están en solución (no unidos al ADN) emiten una fluorescencia baja.

Ejemplo de curva de HRM o high resolution melting
Ejemplo de curva de fusión de un análisis HRM. El gráfico demuestra la fuerte disminución de la fluorescencia cuando el ADN de doble cadena se funde en su forma de cadena simple.

Al principio del análisis HRM hay un alto nivel de fluorescencia en la muestra debido que gran parte de estas moléculas fluorescentes están unidas a los miles de millones de copias del amplicón (de los amplicones).

A medida que la muestra se calienta y las dos cadenas de ADN se separan, la presencia de ADN de doble cadena disminuye, las moléculas fluorescentes vuelven a estar en solución y, por tanto, la fluorescencia se reduce. Esta disminución de la fluorescencia comienza lentamente, pero cuando el ADN de doble cadena pasa a su forma monocatenaria, se detecta una disminución abrupta de la fluorescencia. Esta disminución suele ser mayor cerca de la temperatura de fusión (Tm) del amplicón (de los amplicones). La Tm se define como el punto de la curva de fusión en el que el 50% del ADN es de doble cadena y el 50% es de cadena simple.

La máquina de HRM posee un dispositivo capaz de medir la fluorescencia de la muestra y un software que permite representar los datos detectados en un gráfico conocido como curva de fusión, que muestra el nivel de fluorescencia frente a la temperatura.

El perfil de fusión resultante refleja la mezcla de amplicones presentes. Aspectos como el contenido de GC, la longitud, la secuencia y la heterocigosidad se sumarán a las características de la curva de fusión de cada amplicón. Los perfiles resultantes pueden proporcionar información valiosa para el cribado de mutaciones, el genotipado, la metilación y otras aplicaciones de investigación

¿Cómo funciona el análisis HRM (high resolution melting)?
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