Was ist die HRM-Analyse (high resolution melting)?
Es ist eine in der Molekularbiologie verwendete Technik zum Nachweis von Mutationen, Polymorphismen und epigenetischen Unterschieden in DNA-Proben
Was ist die HRM-Analyse?
Die HRM-Analyse (high resolution melting) ist eine Post-PCR-Analysemethode, die zur Identifizierung genetischer Variation in Nukleinsäuresequenzen eingesetzt wird. Diese einfache und schnelle Methode basiert auf der PCR-Schmelzkurventechnik (Dissoziation). Die HRM-Analyse kann DNA-Sequenzen auf der Grundlage ihrer Zusammensetzung, Länge, ihres GC-Gehalts oder ihrer Strangkomplementarität unterscheiden.
Welche Anwendungen gibt es für die HRM-Analyse?
Wie funktioniert die HRM-Analyse?
Zu Beginn der HRM-Analyse wird eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) durchgeführt, um die DNA-Region zu amplifizieren, in der sich die fragliche Mutation, der Polymorphismus oder der epigenetische Unterschied befindet. Zusätzlich zu den typischen Bestandteilen jeder PCR (Nukleotide, Polymerase, Magnesium) enthält diese PCR einen Fluoreszenzstoff (z. B. SybrGreen), der während der Amplifikation in die doppelsträngige DNA eingefügt wird. Nach Abschluss der PCR befinden sich nun viele Kopien der gewünschten DNA-Region (das so genannte Amplikon) im Probenröhrchen.
Nun beginnt die eigentliche HRM-Analyse, die eine präzise Erhitzung der DNA in der Probe von etwa 50˚C auf etwa 95˚C erfordert. Irgendwann in diesem Prozess wird die Schmelztemperatur jedes der Amplikons in der Probe erreicht und die beiden DNA-Stränge trennen sich.
Der Schlüssel zur HRM-Analyse ist die Überwachung der Trennung der beiden DNA-Stränge in Echtzeit. Zu diesem Zweck stehen derzeit verschiedene fluoreszierende Substanzen zur Verfügung, die sich in die doppelsträngige DNA einlagern und, wenn sie an diese gebunden sind, eine hohe Fluoreszenz aussenden. Wenn sie in Lösung sind (nicht an die DNA gebunden), geben sie eine schwache Fluoreszenz ab.
Zu Beginn der HRM-Analyse ist die Fluoreszenz in der Probe hoch, da viele dieser fluoreszierenden Moleküle an die Milliarden von Kopien des Amplikons gebunden sind.
Wenn die Probe erhitzt wird und sich die beiden DNA-Stränge trennen, nimmt das Vorhandensein von doppelsträngiger DNA ab, die fluoreszierenden Moleküle gehen zurück in die Lösung und die Fluoreszenz nimmt ab. Diese Abnahme der Fluoreszenz beginnt langsam, aber wenn die doppelsträngige DNA in ihre einzelsträngige Form übergeht, wird eine abrupte Abnahme der Fluoreszenz festgestellt. Diese Abnahme ist in der Regel in der Nähe der Schmelztemperatur (Tm) des Amplikons am größten. Die Tm ist definiert als der Punkt auf der Schmelzkurve, an dem 50 % der DNA doppelsträngig und 50 % einzelsträngig sind.
Das HRM-Gerät verfügt über ein Messsystem für die Fluoreszenz der Probe und eine Software, die es ermöglicht, die ermittelten Daten in ein Diagramm, die so genannte Schmelzkurve, einzutragen, die den Fluoreszenzgrad in Abhängigkeit von der Temperatur anzeigt.
Das resultierende Schmelzprofil spiegelt die Mischung der vorhandenen Amplikons wider. Aspekte wie GC-Gehalt, Länge, Sequenz und Heterozygotie tragen zu den Schmelzkurvenmerkmalen der einzelnen Amplikons bei. Die daraus resultierenden Profile können wertvolle Informationen für Mutationsscreening, Genotypisierung, Methylierung und andere Forschungsanwendungen liefern.
